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牙髓干细胞的临床潜能及储存方式

2019-07-26

  自从 1961 年被发现以来,干细胞就一直是再生医学重要的研究对象之一。从较早被应用于临床的造血干细胞,到日本科学家山中伸弥团队发现的诱导多能干细胞,干细胞丰富的来源为人类准备了一个个宝藏。

  牙源性干细胞则是干细胞家族中的后起之秀。

  Gronthos 等科学家在 2000 年发现了牙髓干细胞。3 年后,Miura 等研究者分离出乳牙干细胞。目前为止,科学家们已经发现了多种牙源性干细胞,分为两大类:牙髓相关干细胞和牙周组织相关干细胞。

  ABMSCs:牙槽骨衍生的间充质干细胞,TGPCs:牙胚祖细胞

  牙髓干细胞是目前研究多的牙源性干细胞。

  获取牙髓干细胞相对简单,主要通过拔牙,乳牙、智齿和正畸牙是其常见来源。而乳牙的牙髓组织主要存在于牙根和牙冠中。因此,乳牙的牙根吸收不能超过原长度的1/3 以上,否则可能会对干细胞组织量和活性产生负面影响。采集的牙齿应用杀菌溶液清洗,可减少细菌和真菌污染的风险。

  研究发现,干细胞提取允许的较长时间为离体后120小时内。时间越长,组织活性越低。同时,在牙齿的运输过程中,需要浸入无菌低渗磷酸盐缓冲盐水溶液,并保持在低温条件(4°C),防止牙髓组织坏死。

  牙髓干细胞临床潜能

  2018年8月22日,金岩、施松涛、轩昆、李蓓和郭浩等科学家在《Science Translational Medicine》发表了一项研究成果。他们采集乳牙并分离获得乳牙干细胞,再植入受伤牙齿中,观察到牙齿血运重建及神经功能的恢复。该技术已用于临床近50例患者,成功率达95%。

  这一成果是再生牙领域的重要突破,它将颠覆牙髓病的传统治疗模式,为实现全牙再生奠定基础。

  空军军医大学口腔医院金岩教授介绍牙髓再生术原理

  在其他领域同样具备应用潜能

  从胚胎学角度来看,人类牙齿源自牙齿外胚层(口腔上皮)与神经嵴衍生的间充质(牙齿间质)之间的相互作用。由于同时表现出中胚层和外胚层的特征,牙源性干细胞除了应用于口腔疾病,在其他领域同样具备应用潜能。

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  1、神经系统

  牙髓干细胞(DPSC)起源于颅神经嵴,具有表达神经营养因子等特点,在神经系统疾病的细胞治疗中具有广阔应用前景。将DPSC移植到完全切断的成年大鼠脊髓损伤模型中,结果显示其显著恢复肢体运动功能。DPSC装载于胶原蛋白支架再置入面神经损伤模型中,可使受损轴突重新连接。在动物模型中,DPSC对脑卒中的治疗研究也显示了良好的结果。此外,科学家发现,DPSC对阿尔茨海默病和帕金森病的体外模型具有神经保护作用,可作为神经退行性疾病细胞治疗研究的候选方案。

  2、心脏病

  血管新生和血管生成是缺血性心脏病的一种潜在治疗方法,是再生医学研究的一个值得关注的领域。SP细胞(side population cells)已在人牙周韧带细胞和猪牙髓组织中得到鉴定,具有丰富的干细胞活性。Iohara等人证实从牙髓细胞得到的的SP细胞,具有血管生成特性。

  3、肝硬化

  脱落乳牙可用于儿童和成人肝功能障碍患者的细胞治疗。第三磨牙干细胞在细胞培养中可分化为肝细胞,在肝脏疾病的动物模型中,它们可阻止肝纤维化,升高白蛋白和胆红素的水平。Cho等人的研究表明,褪黑激素可以促进DPSC的肝脏分化。他们认为DPSC和褪黑素联合移植可能是治疗肝硬化的一种可行的方法。

  4、糖尿病

  有报道称DPSC具有分化为类似胰岛样细胞集合体细胞谱系的潜力。Carnevale等人报道,DPSC在适当刺激下,可表达胰腺β细胞发育和功能的基因。Kanafi等人研究了从DPSC衍生的胰岛样细胞簇在糖尿病小鼠体内的移植情况,实验性糖尿病小鼠的高血糖水平可被逆转到正常水平。这些结果提示牙髓干细胞可用于糖尿病患者的治疗。

  5、眼科

  DSC作为一种自体干细胞源已成功应用于角膜盲的治疗。由于和角膜具有相似的胚胎细胞源,DPSC可在体外分化为角质细胞,生成组织工程化角膜基质样组织结构,并在体内作为角质细胞发挥作用,而不会引起明显的排斥反应。

  6、骨组织工程

  DPSC的成骨分化能力在体内外都得到了很好的证实,并且在新生骨中表达骨特异性标志物。Lucaciu等人观察到成骨细胞自发分化趋势,认为DFSCs可用于改善钛种植体表面的骨再生。Maraldi等人也在大鼠颅骨临界大小缺陷模型中使用了DPSC,种植DPSC的胶原海绵在8周时几乎完全将缺陷修补。体内外实验结果表明,在支架材料中添加DPSC具有很大的临床应用潜力。

  牙髓干细胞的冻存

  目前,可供选择的冷冻方案有几种,取决于干细胞库的软硬件情况。

  1、速率不受控冷冻

  一种简单、廉价的替代方案,不需要经过培训或掌握特定技术。首先将冷冻保护剂与样品预冷至4℃,然后直接置于-80℃的冰箱或液氮中。目前的研究发现,速率不受控冷冻仍然是长期低温保存牙髓干细胞的常用廉价方案,对细胞活力、多能性、增殖和分化影响较小。

  2、控制速率冷冻

  为了使干细胞损伤小化,可引入控制冷冻速率的方法。慢速冷冻速率(SRF)每分钟降温1-2℃,通常是低温保存期间维持干细胞活力的较好选择。而费用更昂贵的超慢速冷冻速率(USFR),每分钟降温 0.3至0.6℃。与快速冷冻方法相比,上述方法在解冻后表现出更高的细胞生长和活力。例如,Huynh等人发现,与快速冷冻方法相比,控制速率冷冻方法可显著增加活细胞数量。

  3、玻璃化快速冷冻

  玻璃化快速冷冻法的原理是在高浓度冷冻保护剂中形成玻璃化样固体,从而对细胞起到保护作用。这种方法已经在人类胚胎干细胞、卵母细胞和精子的低温保存中得到很好应用。例如Jadoon等人2015年的研究发现,相比慢速冷冻,快速冷冻法能够得到更多存活的玻璃化卵母细胞(70.3% vs 12.5%)。

  研究快速冷冻用于牙源性干细胞低温保存的论文较少。Huynh等人的研究发现,快速冷冻法冷冻保存6个月的牙髓干细胞在解冻后不再生长,而控制速率冷冻获得的活细胞数量显著增加、生长速度更快。

  4、磁性冷冻

  磁性冷冻保存是一种特殊的受控慢速冷冻技术。研究证明磁场在冷冻期间降低水的聚集,有利减少冰晶的形成以及弱电流的产生,细胞在冷冻期间得到更好保护。

  到目前为止,研究证实该技术可以有效地冷冻保存完整的牙齿以及分离的牙髓干细胞。Lee SY等观察了不同浓度DMSO下的磁性冷冻保存对大鼠完整牙齿和牙髓组织的影响。他们认为,相对其他方式,磁性冷冻是保存完整牙齿和牙髓组织的有效方法。解冻后,采用该方法保存的牙齿及牙髓组织可回收具有更高生物活性的牙髓干细胞。

  完整的冷冻保存方案的建立和优化,除了上述 4 种冷冻方法的选择,还应包括牙齿的采集和运输、干细胞的分离和扩增、冷冻保护剂的种类和浓度、细胞解冻方案的优化、解冻温度的确定等。

  绝大部分牙源性干细胞低温保存的研究,都在关注如何保存成功分离和扩增的干细胞谱系。不过,也有一些研究者在尝试冻存完整的牙齿。全牙冻存可以在需要时再实施各种繁杂的程序,但该方法目前还存在一定局限性。

  此外,长期低温保存对组织和细胞的影响也是一个关注点。施松涛、王松灵等研究者2010年发表的一篇文章指出,冻存对根尖牙乳头干细胞的生物学和免疫学特性无影响。

  Ram Devireddy等研究者比较了冷冻超过10年、3-7年和新鲜脂肪干细胞的活性,结果发现各组间脂肪形成潜力、解冻后存活力和免疫表型特征没有明显差异。Broxmeyer等研究者发现,冷冻保存长达21年的脐带血CD34+细胞在原发性和继发性免疫缺陷小鼠中仍具有长期移植能力(≥6个月),表明脐带血造血干细胞在长期冻存后功能能够恢复。

  不过,冷冻保存方案仍然是一个值得深入研究的领域,需要进一步的全面研究才能得出有效的结论。

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